Транскрипция in vitro — это процесс получения молекул РНК на матрице ДНК за пределами живой клетки «в пробирке». Использование данного метода позволяет создавать специфические последовательности РНК для различных целей, таких как изучение экспрессии генов и получение РНК для функциональных или структурных исследований. С помощью проведения транскрипции in vitro можно нарабатывать различные виды РНК, включая короткие регуляторные и направляющие РНК для систем геномного редактирования. В настоящий момент наблюдается особый интерес к получению искусственных матричных РНК (мРНК), с помощью которых можно решить множество научных задач: экспрессия репортерных белков, доставка систем геномного редактирования, временная экспрессия гена-мишени, оценка эффективности новых систем доставки.

Для обеспечения наработки функциональной молекулы мРНК необходимо учитывать целый ряд ее структурно-функциональных особенностей (Рис.1). Ключевая задача при синтезе – создать молекулу мРНК, структура которой будет имитировать ее созревание внутри клеток. С 5’-конца в эукариотических мРНК находится КЭП – особый модифицированный нуклеотид, обеспечивающий защиту транскрипта от деградации под действием экзонуклеаз. С 3’-конца молекулу защищает длинная цепь из остатков аденозинмонофосфата (поли(А)-хвост). 5'-кэп и полиА-хвост обеспечивают успешную посадку рибосомы для эффективной инициации трансляции с матрицы мРНК. Кодирующая область мРНК обычно с двух сторон фланкирована структурированными нетранслируемыми регионами, которые регулируют трансляционную активность и стабильность мРНК. Кроме того, особую роль в обеспечении длительной функциональной активности и стабильности мРНК выполняют различные модифицированные нуклеотиды, которые формируются специальными ферментами в кодирующей и в нетранслируемых областях молекулы. Наиболее полную картину модификаций в мРНК и длинных некодирующих РНК можно изучить по результатам исследований, собранных в базах данных, например, RMBase v3.0, так как этому направлению даже дали отдельное название «эпитранскриптомика». Хотя роль отдельных модификаций вызывает по-прежнему живой научный интерес и пока до конца не изучена, ученые уже придумали, как использовать такие модификации для улучшения свойств искусственных РНК.

Рис.1 Структура мРНК

Конечно, в самом начале нужно сказать, что работа с РНК требует особой аккуратности: нужно обязательно использовать перчатки и халаты, проводить эксперименты в специально отведенных «чистых» местах, так как любые загрязнения и сами операторы работы являются активным источником нуклеаз, которые быстро разрушают РНК. В комнате, в которой планируется синтез РНК нельзя работать с препаратами РНКаз, даже в низких концентрациях! Все растворы для работы с РНК должны быть приготовлены на воде, обработанной DEPC. Мы рекомендуем использовать для растворения и разбавления растворов РНК специально подготовленную воду SP010-05, которую можно найти в разделе «Отдельные компоненты для ПЦР»

Синтез мРНК начинается с подготовки матрицы для транскрипции. Обычно, в качестве ДНК-матрицы выступает линеаризованная плазмида или фрагмент ДНК, полученный методом ПЦР, который содержит целевой ген или иную заданную последовательность (Рис.2). Для создания заданных конструкций рекомендуем использование Фьюжн ДНК-полимеразы и Т4-ДНК-лигазы от компании «Биолабмикс» (E-2050). Для выделения и очистки плазмидной ДНК рекомендуем использование набора от компании «Биолабмикс» (Plasmid-250-mini или Plasmid-20-maxi). В случае использования плазмиды в качестве матрицы, ДНК должна быть линеаризована по сайту, который ограничивает длину матрицы и обеспечивает остановку полимеразы в нужном положении. Кроме того, рекомендуем очищать ДНК–матрицу перед постановкой реакции транскрипции с использованием набора DR.

Рис. 2 Процесс подготовки ДНК-матрицы для транскрипции

Если в качестве матрицы планируете использовать ПЦР-фрагмент, то ПЦР с целевого участка геномной, вирусной или плазмидной ДНК рекомендуем проводить только с использованием высокоточной полимеразы. Это необходимо для того, чтобы предотвратить возникновение нуклеотидных замен в матрице, которые могут привести к нарушению функциональной активности синтезированной мРНК. Для получения длинных продуктов ПЦР нужно использовать высокоточную Фьюжн ДНК-полимеразу (Pfu-Sso7d) из каталога компании «Биолабмикс». Если необходимо подобрать условия амплификации, то удобнее будет использовать набор для проведения ПЦР с Фьюжн ДНК-полимеразой (KH041-500).

Важно!

В процессе подготовки матрицы также необходимо учитывать несколько важных аспектов. Во-первых, она должна содержать промоторную последовательность, распознаваемую РНК-полимеразой. Например, в случае использования ДНК-зависимой РНК-полимеразы Т7 от компании «Биолабмикс» (E-1010), матрица, соответственно, должна содержать T7 промотор. Во-вторых, необходимо корректировать последовательность следующую за промотором в зависимости от варианта аналога кэпа, используемого в эксперименте.

В настоящий момент в каталоге компании «Биолабмикс» представлено два варианта:

Аналог кэпа m7GmAmG (AGME-0050) или m7(3’OMeG)ppp(2’OMeA)pG – требуемая последовательность за промотором начинается с нуклеотидов AG (подробная инструкция представлена в описании готовых наборов для синтеза cap1-кэпированных мРНК www.biolabmix.ru/catalog/rna-transcription-mrna/transcription-kits/).

Для более хорошо известного аналога кэпа ARCA (ARCA-0050) – требуемая последовательность за промотором начинается с гуанозина, иными словами, первое основание, включаемое в РНК: G; следующие NN: оптимально CG (подробная инструкция представлена в описании готовых наборов для синтеза ARCA-кэпированных мРНК www.biolabmix.ru/catalog/rna-transcription-mrna/transcription-kits/).

Оба кэпа ARCA и m7(3’OMeG)ppp(2’OMeA)pG сконструированы таким образом, чтобы предотвращать возможную встройку в противоположной ориентации за счет наличия 3’-O-метильной группы в составе m7G. Кэп m7(3’OMeG)ppp(2’OMeA)pG обеспечивает более высокую эффективность кэпирования и не ингибирует реакцию транскрипции, что позволяет получать закономерно более высокие выходы при синтезе мРНК (Рис.3). Благодаря наличию 2’-O-метильной группы в составе первого нуклеотида применение m7(3’OMeG)ppp(2’OMeA)pG позволяет получить cap1-кэпированную РНК, которая более эффективно транслируется в клетках млекопитающих.

Рис. 3 Эффективность различных наборов для синтеза мРНК

Рис. 4 Молекулярные механизмы, демонстрирующие вовлеченность модифицированных нуклеотидов в процесс предотвращения активация иммунного ответа

Благодаря работам Нобелевских лауреатов Каталин Карико и Дрю Вайсмана, а также ряда других исследовательских групп в настоящее время хорошо известно, что модифицированные нуклеотиды значительно улучшают свойства искусственных РНК: снижают цитотоксическую активность и подавляют активацию неспецифического иммунного ответа. В клетках млекопитающих экспрессируется целый ряд РНК-рецепторов, которые настроены на детекцию чужеродной РНК. Эти механизмы были созданы и отобраны эволюционно для защиты от заражения вирусами, несущими свой генетический материал в виде РНК. Так, на появление не модифицированной и некэпированной РНК в клетках реагируют Toll-like рецепторы, RIG-I, PKR, белки семейства IFIT. Связывание этих белков с РНК запускает каскады клеточного врожденного иммунного ответа и процессы, направленные на деградацию РНК и остановку трансляции в клетках. На уровне организма появление немодифицированных РНК приводит к выработке цитокинов и воспалительным процессам, которые становятся токсичными. В цикле работ, первые из которых были опубликованы еще в 2005 году, было показано, что включение в состав искусственных РНК модифицированных нуклеотидов, таких как псевдоуридин (Ψ), 5-метилцитидин (m5C), N1-метил-псевдоуридин (m1Ψ) и N6-метиладенозин (m6A), позволяет «обмануть» РНК-рецепторы и предотвратить активацию нежелательных процессов. Сейчас уже описаны подробные молекулярные механизмы, демонстрирующие, что одни модифицированные нуклеотиды препятствуют связыванию РНК с РНК-рецепторами, другие нарушают, конформационные перестройки РНК-белковых комплексов, которые необходимы для передачи сигнала от РНК-рецептора далее на эффекторные молекулы (Рис.4).

Стоит отметить, что стратегию с включением модифицированных природных нуклеотидов используют не только для синтеза мРНК, но и для получения других функциональных РНК, например, коротких регуляторных и РНК для систем CRISPR/Cas.

Портфолио для синтеза РНК компании Биолабмикс содержит весь перечень необходимых модифицированных NTPs для получения функциональных мРНК (Рис.5).

Рис 5. Модифицированные нуклеотиды: (1) N6-метиладенозин-5`-трифосфат (TNA-0050, Биолабмикс); (2) 5-метилцитидин-5'-трифосфат (TMC-0050, Биолабмикс); (3) Псевдоуридин-5'-трифосфат (TPU-0050, Биолабмикс); (4) N1-метил-псевдоуридин-5`-трифосфат (TNP-0050, Биолабмикс)

Основой синтеза целевой молекулы мРНК является реакция транскрипции in vitro. Для ее проведения необходимо собрать все необходимые компоненты: матрицу, РНК-полимеразу (Т7) (E-1010), смесь рибонуклеозидтрифосфатов (rNS-410) (Рис. 6). После чего полученную смесь необходимо инкубировать при температуре 37°C

Рис. 6. Основные компоненты для синтеза мРНК

Для обеспечения стабильности РНК в растворе, в реакцию может быть добавлен ингибитор РНКаз. Рекомендуем использовать ингибитор РНКаз от компании «Биолабмикс» (RI-0020)

В зависимости от последовательности и конечного применения синтезируемой мРНК индивидуальная оптимизация отдельных этапов протокола может улучшить как выход реакции, так и биологическую функцию мРНК. Из литературы хорошо известно, что в состав мРНК можно включить модифицированные нуклеотиды, такие как N1-метил-псевдоуридин (m1Ψ), 5-метилцитидин (m5C), псевдоуридин (Ψ) и N6-метиладенозин (m6A) в разных соотношениях.

К вариабельным параметрам реакции можно отнести изменение времени инкубации или изменение количества ДНК–матрицы. Кроме того, при работе с короткими ДНК–матрицами (< 0.5 т.п.н.) рекомендуется увеличить время инкубации до 4-х часов. Можно инкубировать реакцию при 37°С в течение 16-18 часов (ночь).

Для достижения наилучшего результата рекомендуем использование наборов от компании «Биолабмикс», в которых уже собраны все необходимые компоненты, а также подобраны оптимальные условия для проведения реакции:

Набор для синтеза мРНК in vitro (с ΨTP и m5CTP с m7GmAmG) (AG-mRNA-YC-20)

Набор для синтеза мРНК in vitro (с ΨTP и m5CTP с ARCA) (ARCA-mRNA-YC-20)

Набор для синтеза мРНК in vitro (с кэпом m7GmAmG) (AG-mRNA- 20)

Набор для синтеза мРНК in vitro (с ARCA) (ARCA-mRNA-20)

Очистку синтезированной мРНК можно проводить различными способами: LiCl, фенол-хлороформной экстракции, высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), а также с использованием методов, основанных на спин-колонках. Наиболее удобный и быстрый подход основан на использовании специальных сорбционных колонок. Рекомендуем для рутинных задач использовать набор для очистки из реакционных смесей от компании «Биолабмикс» (DR-250). В случае синтеза коротких РНК рекомендуем использование набора для выделения суммарной и микроРНК из клеток и тканей (LRU-100-50).

Для предотвращения аккумуляции пирофосфата и для повышения выхода РНК в ходе in vitro транскрипции используют фермент пирофосфотазу.

Для удаления примеси ДНК из раствора синтезированной мРНК, необходимо к реакционной смеси добавлять фермент ДНКазу. Обработку ДНКазой можно проводить прямо в транскрипционном буфере непосредственно после реакции. Для достижения наилучших результатов рекомендуем использование термолабильной ДНКазы от компании «Биолабмикс» (EM-100). Термолабильные ДНКазы позволяют проводить инактивацию с помощью нагревания и короткой инкубации при повышенной температуре 55-65°С. Однако, при нагревании нарушается стабильность синтезированных РНК, поэтому мы рекомендуем избегать стадии нагревания и проводить удаление фермента ДНКазы с помощью методов сорбции (например, с использованием наборов DR или RUplus) или ВЭЖХ.

Кроме того, рекомендуем проводить этап удаления фосфатов на 5’-конце, так как некэпированные молекулы РНК с остатками фосфатов являются активными индукторами неспецифического иммунного ответа и способствуют активации процессов деградации РНК в клетках за счет связывания с рядом РНК-рецепторов в клетках.

Проверить качество полученной РНК можно с помощью гель-электрофореза в агарозном геле или с помощью анализа на микрочипах для капиллярного фореза. Для анализа в агарозном геле рекомендуем наносить РНК в Буфере для нанесения на гель «ФриК» (D-3001, Биолабмикс). Количество очищенной мРНК можно оценить с помощью УФ-спектрометрии. Характерный максимум поглощения для РНК: при λ = 260 нм. Для оценки концентрации РНК (мкг/мл) применяется следующая формула: A260 × разбавление × 40 мкг/мл. Характерные соотношения оптической плотности достаточно чистой РНК: A260/A280 ≥ 1.8-2.0, A260/230 ≥ 1.9. Кроме того, рекомендуем использование флуоресцентных методов оценки мРНК, реализованных в приборах Qubit или аналогичных, так как очищенная РНК может содержать примесь невключившихся трифосфатов и фрагментов ДНК-матрицы.

Полиаденилирование - важнейший процесс синтеза мРНК, который заключается в присоединении к 3' концу молекулы мРНК последовательности адениновых нуклеотидов, в результате чего формируется так называемый поли(А)-хвост. Эта пост-транскрипционная модификация играет несколько важнейших ролей в созревании и стабильности мРНК. В составе пре-мРНК имеется определенная последовательность нуклеотидов, называемая сигналом полиаденилирования или поли(А) сигналом. У человека эта последовательность обычно имеет вид AAUAAA.

ПолиА-хвост при получении искусственных мРНК можно добавить в виде кодирующей последовательности в составе исходной плазмиды или ПЦР-продукта, а также используя специальный фермент полиА-полимеразу. Ферментативно удается получить максимальную длину полиА, однако такой подход менее технологичен и его сложно масштабировать. Поэтому вариант полиаденилирования нужно подбирать в зависимости от финальной задачи. В каталоге компании Биолабмикс в ближайшее время появится фермент полиА-полимераза, который отлично подходит для решения научных задач по разработке мРНК-вакцин и мРНК-регуляторов.

Kariko K. et al., Immunity, 23, 165-175 (2005).

Karikó K et al., Mol. Ther. 16(11):1833–1840 (2008).

Anderson B.R. et al., NAR, 38 (2010).

Warren L. et al.., Cell Stem Cell, 7, 618-630 (2010).

Karikó K et al., Mol Ther 20(5):948–953 (2012).

Durbin A. F. et al., mBio, 7 (2016)

Stepanov G.A., Zhuravlev E.S. et al. Genes, (2018).

Prokhorova D.V. et al., The CRISPR Journal, 5 (2022).

Hoy A. et al., The CRISPR Journal, 5 (2022).